Zootecnia Tropical Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas Venezuela ISSN: 0798-7269 Vol. 19, Num. 2, 2001, pp. 115-129

Zootecnia Tropical, Vol. 19, No. 2, 2001, pp. 115-129

Concentración de los metales pesados Cu y Pb y su relación con la actividad enzimática glucógeno fosforilasa y glucógeno sintetasa en el mejillón (Perna viridis)

Concentration of the heavy metal Cu and Pb and their relationship with the synthetase glycogen and phosphorylase glycogen enzymatic activity in the mussel (Perna viridis)

Alicia Arias de Díaz^* y José García

Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas del estado Sucre (INIA – Sucre).
Cumaná. Apdo. postal Nº 236. ^*Correo electrónico: alidiza@cantv.net

Recibido: 28/1/01 Aceptado: 6/6/01

Code Number: zt01011

SUMMARY

In this study, an analysis of the copper (Cu) and lead (Pb) content in the tissue of the green mussel, Perna viridis, and its relationship with the activity of the enzymes glycogen synthetase and glycogen phosphorylase, in order to determine the influence of these chemical pollutants on those. The analysis of the glycogen and the enzymatic activity were carried out, according to the methodology AOAC (1991), Thomas (1968) and Rúa et al. (1988) respectively, using spectrometry of visible light. Heavy metal concentration was determined APHA (1985), using atomic absorption spectrometry. The results point out that the metals Cu and Pb inhibited the activity of both enzymes, necessary for the synthesis and mobilization of the glycogen, what could have a negative effect so much in the process of reproduction of this species, as well in the fisheries and commercialization of the product.

Key Words: Enzymes – Glycogen – Green mussel – Heavy metals-Copper-Lead

RESUMEN

En este estudio se hace un análisis de la concentración de cobre (Cu) y plomo (Pb) en el tejido del mejillón verde Perna viridis y su relación con la actividad de las enzimas glucógeno-sintetesa y glucógeno-fosforilasa, con la finalidad de determinar la influencia de estos contaminantes químicos sobre las mismas. El análisis del glucógeno se realizó según la metodología AOAC (1991), la actividad enzimática, según Thomas (1968) y Rúa et al. (1988), utilizando espectrometría de luz visible y los metales pesados de acuerdo a las sugerencias de  APHA (1985), utilizando espectrometría de absorción atómica. Los resultados señalan que los metales Cu y Pb inhiben la actividad de ambas enzimas necesarias para la síntesis y movilización del glucógeno, lo que pudiera tener un efecto negativo tanto en el proceso de reproducción de esta especie, como en la pesquería y la comercialización del producto.

Palabras clave: Enzimas, Glucógeno, Mejillón verde, Metales pesados, Cobre, Plomo

INTRODUCCIÓN

El mejillón (Perna viridis), conocido como mejillón verde, es una especie originaria del Indopacífico. En 1990 fue detectada por primera vez en el Atlántico, específicamente en Trinidad, extendiéndose hacia la parte oriental de Venezuela, en el Golfo de Paria y Norte del Estado Sucre (Agard et al. 1992), Isla de Margarita y Golfo de Cariaco ( Lodeiros et al. 1999) y gran parte del Caribe. Desde ese entonces, se han realizado estudios sobre diferentes aspectos, entre los que destacan el de Segnini et al. (1998), relacionado con la tolerancia de esta especie a la temperatura y salinidad. Para esta misma especie en otras latitudes, se mencionan los trabajos de Krishnakumar et al. (1990) y Chidambaram (1991), relacionados con metales pesados.

La acumulación de glucógeno como principal carbohidrato de reserva en moluscos bivalvos ha sido motivo de estudios por muchos investigadores desde el año 1915. Posteriormente se ha señalado que el contenido de polisacáridos en estos organismos, depende de las variaciones estacionales (Ansell, 1974; Comely, 1974; Gabbot, 1976; Vázquez y Rosell-Pérez, 1979). Estudios sobre aspectos reproductivos del mejillón Perna perna ( típico de la región hasta la aparición de Perna viridis) realizados por Vélez y Martínez (1967), Vélez (1971) y Vélez y Azuaje (1993) indican que la especie se reproduce durante todo el año, existiendo un ciclo más intenso entre los meses de enero a abril, que coincide con lo observado por Jiménez (comunicación personal, 1999) para Perna viridi.

Estudios más recientes relacionados con actividades enzimáticas y pertenecientes a organismos de estas latitudes han sido orientados a la diferenciación de poblaciones de diferentes especies marinas y aspectos reproductivos (Brokordt et al., 2000); sin embargo, la literatura no reporta trabajos que consideren los efectos o relación de ciertos agentes tóxicos sobre la actividad de las enzimas glucógeno fosforilasa y glucógeno sintetasa.

La enzima glucógeno-fosforilasa moviliza la energía almacenada en el glucógeno y cataliza la liberación de unidades glucosa- 1- fosfato (G-1-P) a partir del polisacárido. Bennett y Nakada (1968) señalaron la presencia de la actividad de esta enzima en moluscos bivalvos y la glucógeno-sintetasa, enzima que tiene la capacidad de sintetizar el glucógeno, la cual fue estudiada por Vázquez y Rosell- Pérez (1978, 1979) y Rúa et al. (1988).

Los metales pesados generalmente forman parte de los elementos constituyentes del agua de mar y se originan por los procesos de vulcanización e hidrotermalismo y de la erosión de las rocas, que durante el ciclo biogeoquímico natural se interrelacionan con el ambiente a través de los desechos y material sedimentario proveniente de las actividades industriales (Gutiérrez et al., 1999) . Según Garrels et al. (1975), en muchos casos esta movilización antropogénica excede a la movilización natural.

La acumulación de metales pesados por organismos marinos es un proceso complejo donde intervienen una serie de mecanismos internos y externos que juegan un papel determinante, tales como: la talla de los organismos (Cossa et al., 1979), la composición bioquímica y factores genéticos (Frazier et al., 1985), los ciclos de desove que afectan la condición y peso (Lobel y Wright, 1982), la biodisponibilidad del metal, la temperatura y la salinidad (Phillips, 1976). Además, es conocido que los moluscos bivalvos, especialmente los mejillones, son utilizados como organismos indicadores o centinelas de la contaminación del ambiente marino, como ha sido reportado por Bonilla (1999), Acosta et al.(1999) y Arias y García (1999). En Venezuela los bancos naturales del mejillón Perna perna y Perna viridis están siendo objeto de una explotación intensiva, que aunado a factores ambientales, a menudo ocasiona una considerables disminución en su producción y comercialización, por lo que se debe tratar de proteger a esta especie, especialmente durante sus períodos de desove.

Por estas razones, es necesario entonces estudiar los diversos aspectos que intervienen en los mecanismos de las actividades de las diferentes enzimas que catalizan reacciones fundamentales en el metabolismo de los organismos marinos, en especial en el mejillón Perna viridis.

Al no disponer de referencias bibliográficas sobre este tema, se ha considerado de interés, realizar este trabajo sobre enzimología básica, para determinar la presencia de las enzimas glucógeno-sintetasa y glucógeno- fosforilasa en el tejido del mejillón Perna viridis y su relación o comportamiento con el contenido de agentes tóxicos (Cu y Pb), con el objetivo de determinar si la concentración de estos contaminantes químicos influyen en la actividad de las enzimas necesarias para la síntesis y movilización del glucógeno.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para realizar esta investigación se utilizaron muestras del molusco Perna viridis (Figura 1), los cuales fueron recolectados en la localidad conocida como Morro Los Garzos, situado en los 10º 41’ de Latitud Norte y 63º 25’ de Longitud Este, frente a Punta Lebranche (Guaca-Guatapanare) estado Sucre, el cual puede ser considerado como un banco natural (Figura 2).

Una vez en el laboratorio, un total de 108 ejemplares, fueron seleccionados según sus tallas en grupos de 36 ejemplares cada uno: grupo I: talla entre 5 – 6 cm; grupo II: 6 - 8 cm; grupo III: 8 - 10 cm, luego sometidos a disección antes de cumplir las 24 horas de haber sido extraídos de su medio natural.

Cada grupo fue dividido para realizar los siguientes análisis:

I. a) Para la determinación del glucógeno, se usó la metodología descrita en AOAC (1991) y sugerida en Methods of Enzymology (1965), homogenizando el tejido con KOH al 30%, durante 30 minutos. El glucógeno se precipitó añadiendo 1,5 ml de alcohol 96%, por cada volumen de muestra digerida. El glucógeno precipitado fue almacenado durante 10 horas a 0ºC para luego centrifugarlo a 2000 x g durante 15 minutos, resuspendido con agua destilada y reprecipitado con alcohol antes de su valoración, empleando el reactivo de Antrona y glucógeno del mejillón M. edulis como control. La determinación de proteínas se realizó según Lowry et al. (1951).

I. b) La actividad de la enzima glucógeno-fosforilasa se determinó en los extractos crudos, obtenidos por homogeneización del tejido con una solución tampón TRIS HCl 50 mM ; EDTA, 20 mM; Mercaptoetanol 10 mM y FNa 50 mM a pH 6,8, luego sometida a centrifugación a 6000 x g, durante 30 minutos. El sobrenadante fue filtrado a través de una fibra de lana, con ayuda de una bomba de vacío.

Para determinar la actividad de esta enzima en función de la cantidad de fósforo inorgánico liberado ( Pi ) al incorporarse la G-1-P al glucógeno, se siguió el método de Fiske y Subbarow (1925), modificado por Rúa et al. (1988). Para la reacción se usó una mezcla del buffer TRIS-HCl ( 50 mM), G1P (15 mM), glucógeno (1%), para un volumen de 100 µL. Para detener la reacción se utilizó H₂SO₄ 0,5N y (NH₄)₂ MoO₄ 0,5%. La mezcla se incubó a 30ºC durante 20 minutos , con la utilización de 5’AMP para el ensayo de la forma inactiva.

I. c) La actividad de la enzima glucógeno-sintetasa se determinó en el extracto crudo obtenido del homogenizado del tejido con el buffer EDTA 0.001 M durante 30 minutos y centrifugado durante 15 minutos a 2000 x g.

La actividad de esta enzima fue medida por la cantidad de UDP formado del UDPG en presencia del glucógeno y G6P, según Thomas (1968). La estimación de UDP se llevó a cabo usando una preparación de piruvato-kinasa, la cual cataliza la transferencia del fosfato del fosfopiruvato a UDP. El piruvato liberado fue estimado por colorimetría a una densidad óptica de 520 mµ. En la determinación de la forma independiente la reacción se realizó en ausencia de G6P.

II. Para la determinación de los metales pesados Cu y Pb, se secaron las muestras por liofilización durante tres días, y luego sometidas a pulverización, homogeneización, luego almacenadas en tubos de ensayo hasta su posterior análisis.

Los análisis para la determinación de los elementos trazas, se realizaron siguiendo la metodología descrita en APHA (1985), sometiendo las muestras a digestión ácida. Los análisis por Espectrometría de Absorción Atómica, utilizando un Perkin – Elmer 3101. El Cu fue medido a 280 nm con un límite de detección de 0,05 µg/g y el Pb a 316 nm con límite de detección 0,04 µg/g.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos indican un contenido de glucógeno con valores comprendidos entre 22,4 y 26,2 mg/g de tejido en peso húmedo para el grupo I, entre 43,5 y 56,1 mg/g para el grupo II y entre 72,8 y 85,2 mg/g para el grupo III (Cuadro 1), observándose un ligero incremento de este polisacárido a medida que aumenta la talla de los organismos (de 5,0 a 9,8 cm) y que coincide con los valores más elevados en el contenido de metales pesados Cu (27,1 ppm) y Pb (5,6 ppm). Por otra parte, si la reserva de glucógeno presente en los organismos del grupo III (77,2 mg/g de promedio) se obtiene a partir del glucógeno muscular y es utilizada como fuente de energía para la función gametogénica (Comely, 1974), por lo que se puede decir entonces, que los valores de glucógeno encontrados están en relación directa con la cantidad de alimento disponible en el medio y con la biodisponibilidad de los tóxicos en el mismo.

Cuadro 1. Rango de valores del contenido de glucógeno, actividad de las enzimas glucógeno-fosforilasa, glucógeno-sintetasa y metales pesados Cu y Pb en el tejido del mejillón (Perna viridis)

El contenido de Cu entre 15,3 a 27,1 ppm para los grupos I ,II y III, y los valores de Pb entre 2,5 y 5,7 ppm obtenidos para todos los grupos en el mejillón Perna viridis, pueden ser discutidos en base a que la acumulación por metales en esta especie está influenciada por la presencia en la zona, que puede ser debido al aporte de las actividades industriales y de los procesos de surgencia (Bonilla, 1999). Especialmente, pudiese deberse a mecanismos de incorporación y acumulación de material particulado presente en los sedimentos provenientes de descargas de aguas y sedimentos de ríos y desechos domésticos de zonas rurales cercanas, como ha sido señalado por Arias y García (1999).

La Ley Orgánica del Ambiente para nuestro país, contempla que estos tóxicos deben ser no detectables tanto en este tipo de ambiente, como en los recursos pesqueros de importancia comercial. Por lo tanto, los valores de Cu y Pb señalados en este trabajo reflejan la contaminación del ambiente marino.

En cuanto a la actividad de la enzima glucógeno–fosforilasa, se observa que ésta alcanza sus máximos valores en los organismos pertenecientes al grupo I y los mínimos concuerdan con los valores altos de la reserva de glucógeno; es decir, organismos del grupo III. Bajo estas condiciones estos últimos estarían obteniendo la energía a partir del polisacárido. Por otra parte, de acuerdo con los datos obtenidos, el proceso catalítico de la enzima glucógeno-fosforilasa está en relación inversa a la concentración de los metales estudiados (Figuras 3 y 4), lo que significa que la actividad enzimática es menor al aumentar la concentración de Cu y Pb.

Vásquez et al. (1973) demostraron que la enzima glucógeno-sintetasa se presenta en el tejido del mejillón en dos formas: una denominada D, que depende de G-6-P para mostrar actividad y la otra forma es la I, que no requiere de la presencia de ese azúcar para mostrar su actividad. En Perna viridis, las determinaciones de glucógeno permiten señalar la presencia de las dos formas en ambas enzimas: a) una activa (I) , sin la presencia de G6P ( independiente), b) la menos activa (D), indicando que la enzima glucógeno-fosforilasa se encuentra en su forma activa, hasta que la concentración de metales es menor de 25 ppm y 5 ppm para el cobre y plomo, respectivamente, como puede observarse en las Figuras 3 y 4. Esto también indica que mientras que la G-6-P estimula la síntesis del glucógeno, es capaz también de inhibir la degradación del mismo, especialmente cuando existen factores negativos en el medio (Cu y Pb), mientras que la transformación de la forma menos activa o inactiva de la fosforilasa a su forma activa puede ser inhibida por dicho azúcar tal como fue señalado por Vázquez et al. (1973) y que corrobora lo reportado por Rúa et al. (1988).

La glucógeno-sintetasa muestra su actividad cuando las concentraciones de Cu y Pb son aproximadamente 20 ppm y 6 ppm respectivamente, para luego mantener una cierta estabilidad debido posiblemente a la saturación del metal en el medio acuático, en el mismo organismo o a un mecanismo de regulación metabólica, especialmente del Cu, como ha sido reportado por Phillips y Segar (1986).

CONCLUSIONES

Los resultados de este estudio permiten señalar que Perna viridis presenta las enzimas necesarias, tanto para promover la movilización del glucógeno almacenado, como para la síntesis del glucógeno como sustancia de reserva cuando las condiciones del medio no le son favorables (Cu = 27,1 ppm y Pb = 5,70 ppm). Sin embargo, el cobre disminuye notoriamente la actividad de ambas enzimas, mientras que el plomo ejerce su acción más marcada sobre la actividad de la glucógeno-fosforilasa.

En base a la hipótesis de que las funciones normales de estas enzimas necesarias para proporcionar la energía, tanto en los procesos metabólicos lentos y estacionales, como la gametogénesis, o rápidos como el desplazamiento por el cierre valvar, estarían siendo alterados con la presencia de estos tóxicos. Se puede decir entonces que el contenido de estos contaminantes (Cu y Pb), pudiera tener una influencia negativa en el proceso de reproducción de esta especie, lo que también tendría una fuerte repercusión tanto en la pesquería como en la respectiva comercialización, además de los problemas de salud pública que pudiera causar a través de su consumo.

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